Table of Contents
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TITELBLATT,INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG.................................................................................1
1.1 Das Konzept einer Large-Scale Analyse in der Biologie......................................1
1.2 Funktionelle Genomanalyse..................................................................3
1.3 Proteomanalyse - die Wiederentdeckung der Proteine.........................................4
1.4 Proteomanalyse - Stand der Technik.........................................................7
1.4.1 Gelsysteme.................................................................................7
1.4.2 Proteinextraktion..........................................................................9
1.4.3 Quantitative Analyse von 2D-Mustern.......................................................10
1.4.4 Bildanalyse von 2D-Mustern................................................................10
1.4.5 Massenspektrometrie von Proteinen.........................................................11
1.5 Proteomanalyse im Vergleich zur Genomanalyse..............................................12
1.5.1 Methodische Aspekte.......................................................................12
1.5.2 Syntheserate und zelluläre Konzentration der Proteine.....................................13
1.5.3 Posttranslationale Modifikationen der Proteine............................................13
1.6 Die genetische Analyse als Bindeglied zwischen Genom und Proteom..........................15
1.6.1 Proteinpolymorphismen.....................................................................15
1.6.2 Das Netzwerk zwischen Gen- und Proteinebene...............................................17
1.7 Genetische und physikalische Kartierung von Proteinen der Maus
Ansatzpunkte zur eigenen Untersuchung.....................................................18
1.7.1 Ein Europäisches Kollaborationsprojekt zur genetischen Kartierung der Maus(EUCIB).........18
1.7.2 Die physikalische Karte des Mausgenoms....................................................19
1.7.3 Ansatz und Ziele der eigenen Untersuchungen...............................................20
II. MATERIAL UND METHODEN.....................................................................22
2.1 Molekulargenetische Untersuchungen........................................................22
2.1.1 Material..................................................................................22
Enzyme....................................................................................22
Grössenstandards..........................................................................22
Oligonukleotide...........................................................................22
Gefässe...................................................................................23
DNA- und Protein-bindende Membranen.......................................................23
Geräte....................................................................................23
Puffer und Medien.........................................................................23
Klonbanken................................................................................24
2.1.2 Versuchstiere.............................................................................25
2.1.3 Methoden..................................................................................28
Mikrobiologische Methoden.................................................................28
Molekularbiologische Methoden.............................................................28
2.2 Biochemische Untersuchungen...............................................................34
2.2.1 Material..................................................................................34
Chemikalien...............................................................................34
Geräte....................................................................................34
Lösungen..................................................................................34
2.2.2 Versuchstiere.............................................................................35
2.2.3 Methoden..................................................................................35
Präparation von Gehirnen..................................................................35
Proteinextraktion.........................................................................35
2D-Elektrophorese.........................................................................36
Färbetechniken............................................................................36
Massenspektrometrie.......................................................................37
2.3 Erfassung der genetischen Daten aus 2D-Proteinmustern.....................................38
2.4 Genkartierung.............................................................................40
2.4.1 Zusammenstellen der Protein- und DNA-Segregationsdaten in Dateien.........................40
2.4.2 Berechnung der genetischen Karte..........................................................40
Untersuchung paarweiser Kopplung (two-point linkage)......................................41
Mehrpunkt-Analyse (multipoint analysis)...................................................41
Kontrollen................................................................................41
III. ERGEBNISSE................................................................................42
3.1 Segregationsanalyse von DNA-Polymorphismen................................................42
3.1.1 Bedeutung und Häufigkeit von DNA-Polymorphismen und ihre Darstellung mittels
genetischer Marker: RFLP-Marker, SSLP-Marker und IRS-PCR-Marker...........................42
3.1.2 Vorgehensweise bei der Genotypisierung der B1-Mäuse durch IRS-PCR-Marker..................44
3.1.3 Kartierungsdaten der IRS-PCR-Marker.......................................................46
3.1.4 Datenqualität.............................................................................49
3.1.5 Einsatzmöglichkeiten der IRS-PCR Marker für andere Mäusekreuzungen........................51
3.1.6 Kartierungsdaten für Mikrosatellitenmarker................................................53
3.2 Segregationsanalyse von Protein-Polymorphismen - Ergebnisse aus 2D-Mustern................55
3.3 Eine genetische Karte aus DNA- und Proteinpolymorphismen..................................57
3.3.1 Vorbemerkung zur Genkartierung............................................................57
3.3.2 Genkartierungsdaten.......................................................................59
Der Ausgangspunkt der Kartierung: die Rahmenkarte (framework map).........................59
Erweiterung der Rahmenkarte mit IRS-PCR und Mikrosatellitenmarkern........................59
Integration von Proteindaten in das DNA-Marker Netzwerk...................................64
Integration der MSO-Marker des EUCIB Projektes in die genetische Karte....................65
3.3.3 Datenqualität.............................................................................66
3.3.4 Verteilung der kartierten Proteine auf die einzelnen Chromosomen
- Vergleich mit der MBx-Datenbank........................................................66
Die Kartenlänge in Abhängigkeit von der Kartierungsfunktion...............................69
3.4 Identifizierung von genetisch kartierten Proteinspots durch Massenspektrometrie...........71
3.5 Physikalische Kartierung nichtpolymorpher Proteinspots von 2DE-Gelen......................77
3.5.1 Vorgehensweise............................................................................77
3.5.2 Proteinidentifizierung und Identifizierung eines entsprechenden cDNA-Klons................78
3.5.3 Kartierung von I.M.A.G.E cDNA-Klonen mittels IRS-PCR auf YAC-Klonen.......................80
Identifizierung von genomischen BAC-DNA-Klonen für IRS-PCR................................80
Herstellung der IRS-PCR Produkte von genomischen BAC-DNA Klonen...........................82
Hybridisierung von IRS-PCR Produkten der BACs gegen YAC-Klonbanken........................82
IV.
DISKUSSION................................................................................89
4.1 Genetische Kartierung bei der Maus........................................................89
4.2 Markersysteme.............................................................................90
4.3 Die Beobachtung: Proteinspots eines 2DE-Musters zweier Mausstämmen zeigen Variationen.....92
4.3.1 Sind die Variationen der Proteinspots der Mäusestämme Mus spretus und
Mus musculus genetisch bedingt?...........................................................92
4.3.2 Welche Variationstypen wurden gefunden und welchen Erbgängen folgen sie?..................93
4.3.3 Die molekulare Basis von genetischer Variation............................................95
4.3.4 Häufigkeit von Proteinpolymorphismen zwischen zwei Mäusespezies...........................96
4.3.5 Detektierbarkeit von Mutationen mittels 2D-Elektrophorese.................................97
Quantitative Variabilität der Proteine....................................................99
4.3.6 Praktische Anwendungen: Sind Proteinpolymorphismen als genetische Marker einsetzbar?.....100
4.4 Die Identifizierung kartierter, polymorpher Proteinspots mit MALDI Massenspektrometrie
enthüllt abweichende Kartierungsergebnisse...............................................101
4.4.1 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots mV147............................102
4.4.2 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots paV410...........................103
Wie sicher ist unsere Kartierung: besteht Kopplung zu anderen Regionen des Genoms?.......104
4.4.3 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots mV134............................105
Wie sicher ist unsere Kartierung: besteht Kopplung zu anderen Regionen des Genoms?.......105
4.4.4 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots paV419...........................106
Wie sicher ist unsere Kartierung: besteht Kopplung zu anderen Regionen des Genoms?.......106
4.4.5 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots aV19.............................108
Wie sicher ist unsere Kartierung: besteht Kopplung zu anderen Regionen des Genoms?.......108
4.4.6 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots mV82.............................109
4.4.7 Die abweichende Kartierung des polymorphen Proteinspots mV248............................109
4.5 Zusammenfassend: Anwendungen der Proteinkartierungen.....................................110
4.5.1 Neukartierte Proteine als Kandidaten für Krankheitsloci..................................111
4.5.2 Proteinphenotypen - wer verursacht den Phänotyp?.........................................114
4.5.3 Identifizierung von variantem und nichtvariantem Spot des 2D-Gels........................115
4.5.4 Nichtkartierbare Proteinpolymorphismen...................................................117
4.6 Die Biologische Aussage der Kartierung von Interspezies-Polymorphismen...................119
Der Prozess der Artbildung...............................................................119
Die Auflösung der genetischen Karte - warum kartieren viele Proteine auf gleiche
Positionen?..............................................................................120
Analyse der Spotgruppen identischer, genomischer Position hinsichtlich der Abschätzung
der Anzahl verschiedener Proteine auf einem 2DE-Gel......................................122
4.7 cDNA-Kartierung - die physikalische Alternative..........................................124
V.Referenzen...............................................................................128
ANHANG
Chromosomenkarten:
Chromosom 1,
2, 3,
4, 5,
6, 7,
8, 9,
10, 11,
12, 13,
14, 15,
16, 17,
18, 19 und X der Maus
Legende zu den Chromosomenkarten
Tabelle1:
Liste der polymorphen Proteinspost und Varianten in der cytosolischen Fraktion von Maus Gehirn.
Kartierungsposition, Kopplungswahrscheinlichkeiten und genetische Abstände
Legende zu Tabelle 1
Tabelle 2: Liste von polymorphen und nicht-polymorphen Spots, die zur selben Spotfamilien gehören,
jedoch auf mehrere verschiedene Positionen der Mauschromosomen kartieren
Veröffentlichte Arbeiten
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