FU Berlin Digitale Dissertation
Ingo Marenholz : Molekulargenetische Charakterisierung des Epidermalen Differenzierungskomplexes (EDC) auf Chromosom 1 des Menschen Molecular Genetic Characterization of the Epidermal Differentiation Complex (EDC) on Human Chromosome 1
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung In den letzten Jahren wurden auf dem langen Arm von Chromosom 1 des Menschen drei strukturell verwandte Genfamilien lokalisiert, die für die Ausbildung einer intakten Epidermis von entscheidender Bedeutung sind. Sie codieren sowohl strukturgebende als auch regulatorisch wirkende Proteine, die während der Differenzierung der Epidermis funktionell zusammenspielen. Die koordinierte Expression der Gene führte in Verbindung mit ihrer Anordnung innerhalb eines eng begrenzten Bereichs der Region 1q21 zur Definition eines neuen Genkomplexes, des Epidermalen Differenzierungskomplexes (EDC, epidermal differentiation complex). Zwei für die Charakterisierung des EDC unverzichtbare Ressourcen wurden im Rahmen dieser Arbeit geschaffen. Als erstes ist das aus 24 YACs (yeast artificial chromosomes) bestehende Contig zu nennen, das sich über 6 Mb der Region 1q21 erstreckte. Insgesamt 43 Genmarker, 20 neue, 1q21-spezifische Hybridisierungsmarker und sieben polymorphe STS (sequence-tagged site)-Marker wurden innerhalb des Contigs kartiert; bis auf zwei kleinere Abschnitte war die Region mindestens doppelt mit DNA-Klonen abgedeckt. Durch Zwei-Farben-FISH (Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung) zweier, den EDC begrenzender, YACs wurde die Orientierung des Genkomplexes auf Chromosom 1 bestimmt. Um die Auflösung des Contigs zu erhöhen, wurde eine SalI-Restriktionskarte der YACs erstellt und, um die Ergebnisse zu verifizieren, zusätzlich eine genomische Restriktionskarte, die ca. 4,5 Mb der Region 1q21 umfaßte. Die Positionierung von sieben STS-Markern der genetischen Karte auf den YACs führte zur integrierten Karte der Region 1q21, die für Kopplungsanalysen besonders wertvoll ist. Für die Analyse der während der Differenzierung der Epidermis exprimierten Gene wurde das zweite Hilfsmittel angefertigt, eine feingerasterte cDNA-Bibliothek aus Keratinozyten unterschiedlicher Reifegrade. Diese war sowohl aufgrund ihrer Größe (10 Filter mit je 18432 doppelt aufgetragenen Klonen) als auch der enthaltenen cDNA-Sequenzen, die selbst späte Differenzierungsstadien einschlossen, einzigartig und ermöglichte die systematische und schnelle Analyse nahezu des gesamten bei der Keratinozytenreifung vorliegenden Transkriptoms. Für die Verwaltung der cDNA-Bibliothek wurde eine zentrale Datenbank angelegt, in der alle erzielten Ergebnisse gespeichert und ausgewertet wurden. Zusätzlich wurde eine Methode zur Genidentifizierung weiterentwickelt, die YACs als Sonden für die Hybridisierung einer cDNA-Bibliothek nutzt. Durch subtraktive Hybridisierung einer feingerasterten cDNA-Bibliothek mit nicht überlappenden YACs konnten zuvor beschriebene Probleme mit falsch positiven Klonen nahezu vollständig gelöst werden: Fast 90% der subtraktiv ausgewählten cDNA-Klone konnten im EDC kartiert werden. Die cDNA-Sequenzen repräsentierten 40 verschiedene Transkripte, die von 33 Genen stammten. Von diesen konnten 21 Gene erstmals dem EDC zugeordnet wurden: ADAR1, ANXA9, HAX1, LAMRL6, PIAS3, PIP5K1A, PSMB4, PSMD4, PSMD8L, RBM8 und TPM3 sowie zehn zuvor nicht charakterisierte Gene (NICE1 bis NICE10), von denen eines eine Homologie zum NOTCH2-Gen aufwies. Vier weitere Gene, CHRNB2, RPTN, S100A11 und TDRKH, wurden unabhängig von der subtraktiven Hybridisierung im EDC lokalisiert. Die bekannten Genfamilien des EDC konnten mit RPTN und S100A11 um zwei neue Mitglieder erweitert werden; außerdem wurde ein polymorphes Transkript des SPRR3-Gens identifiziert. Expressionsuntersuchungen und Sequenzanalysen des NICE1-Gens, das ebenfalls in der ursprünglichen EDC-Region kartiert, lassen eine neue, differenzierungsspezifisch exprimierte Genfamilie innerhalb des EDC vermuten. Durch die Zuordnung der entsprechenden Gene im Mausgenom konnte eine orthologe Kopplungsgruppe auf dem Mauschromosom 3 belegt werden. Ebenso konnten paraloge Regionen auf den Chromosomen 1, 6, 9 und 19 im menschlichen Genom aufgezeigt werden. Darüberhinaus bestätigen vier neue EDC-Gene, denen homologe Gene auf dem langen Arm von Chromosom 15 zugeordnet werden konnten, Hinweise auf eine fünfte paraloge Region - ein weiterer Schritt zur Aufklärung der Chromosomenentwicklung. Der EDC konnte als Ergebnis dieser Arbeit von 2 auf 6 Mb ausgedehnt werden, innerhalb der jetzt 52 Gene kartieren, von denen fast alle in Keratinozyten exprimiert werden und die somit potentiell am Aufbau der Epidermis beteiligt sind. Da die Transkriptionsanalyse der Region nicht erschöpfend durchgeführt wurde, wird ihre Zahl voraussichtlich noch zunehmen. Auch ist die tatsächliche Ausdehnung des EDC auf Chromosom 1 noch unbekannt, so daß weitere Analysen dieser außergewöhnlichen Region des menschlichen Genoms erstrebenswert sind.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: Titel I Inhaltsverzeichnis III Danksagung VII Symbole und Abkürzungen IX I EINLEITUNG 1 1 Die Haut - Aufbau und Funktion 1 2 Die Differenzierung der Epidermis 2 3 Molekularbiologie der Keratinozyten 4 4 Die Bedeutung der Region 1q21 für die Epidermisdifferenzierung 9 5 Der Epidermale Differenzierungskomplex (EDC) 12 6 EDC-assoziierte Krankheiten 12 7 Genomanalyse 15 8 Genetische Kartierung 16 9 Physikalische Kartierung 17 10 Methoden zur Identifizierung neuer Gene 20 11 Das Humangenom-Projekt 22 12 Ziele der Arbeit 25 II MATERIAL & METHODEN 27 1 Geräte 27 2 Arbeitsmaterial & Hilfsmittel 27 3 Reagenzien 28 4 Enzyme 29 5 Reagenziensets 29 6 Nucleinsäuren 30 6.1 Vektoren 30 6.2 DNA-Sonden 30 6.3 Oligonucleotid-Primer 31 6.4 Molekulargewichtsstandards 31 7 DNA-Bibliotheken 32 8 Lösungen 32 8.1 Stammlösungen 32 8.2 Puffer 33 8.3 Nährmedien 35 9 Zellen und ihre Aufzucht 35 9.1 Zellkultur 35 9.2 Hefekultur 36 9.3 Bakterienkultur 36 10 DNA-Isolierung 36 10.1 Genomische DNA des Menschen (hoch- bzw. niedermolekular) 36 10.2 DNA aus Hefezellen (hoch- bzw. niedermolekular) 37 10.3 YAC-DNA (Elektroelution) 38 10.4 Plasmid-DNA 39 10.5 Plasmidinserts (Elution mit Glas-beads) 39 10.6 Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäuren 40 11 Restriktionsanalyse 40 11.1 Restriktion von DNA in Lösung 40 11.2 Restriktion von DNA in Agarose 40 12 DNA-Klonierung 41 12.1 Ligation 41 12.2 Herstellung kompetenter Zellen 42 12.3 Transformation 42 13 Gelelektrophorese 43 13.1 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) 43 13.2 Agarosegelelektrophorese 43 13.3 Gelelektrophorese im rotierenden Feld (ROFE) 43 13.4 DNA-Nachweis mit Ethidiumbromid 44 14 Southern-Blotting 44 15 Radioaktive Hybridisierung 45 15.1 DNA-Sonden 45 15.2 Markierung der Sonde 45 15.3 Hybridisierung 46 15.4 Autoradiographie 47 16 Polymerasekettenreaktion (PCR) 48 17 DNA-Sequenzierung (Didesoxy-Verfahren) 49 17.1 Sequenzierungsreaktion 49 17.2 Denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese 50 17.3 Detektion und Fehlerkorrektur 50 18 Computergestützte Sequenzanalysen 51 19 Herstellung einer feingerasterten (gridded) cDNA-Bibliothek 51 19.1 Aufziehen der Klone 52 19.2 Automatisches Auflesen der Klone (picking) 54 19.3 Vervielfältigung der cDNA-Bibliothek (replicating) 54 19.4 Automatisches Aufbringen der Klone auf Membranen (spotting) 55 19.5 Verarbeiten der Filter (processing) 56 19.6 Verwalten der cDNA-Bibliothek 56 III ERGEBNISSE 58 1 Erstellung eines YAC-Contigs der Region 1q21 58 1.1 Auswahl der YAC-Klone 58 1.2 YAC-Größenbestimmung 61 1.3 Charakterisierung instabiler YACs 61 1.4 Zusammensetzen eines Contigs des EDC 62 1.5 Erweiterung des Contigs durch die Integration genetischer Marker 63 1.6 Herstellung und Kartierung neuer Sonden zur Erhöhung der Markerdichte 66 1.7 Identifizierung rearrangierter YACs 67 1.8 Chromosomale Orientierung des EDC 67 1.9 Diskussion 69 2 Identifizierung neuer EDC-Gene durch subtraktive Hybridisierung 70 2.1 Eine direkte Methode zur Identifizierung neuer Gene 71 2.2 Hybridisierung der feingerasterten cDNA-Bibliothek mit einem YAC 71 2.3 Auswertung der Hybridisierung 72 2.4 Hybridisierung der feingerasterten cDNA-Bibliothek mit einem zweiten YAC 75 2.5 Subtraktive Auswertung 75 2.6 Hybridisierungsergebnisse zweier weiterer YACs aus der centromeren Region 78 2.7 Mögliche Fehlerquellen und ihre Vermeidung 78 3 Kartierung der neuen EDC-Gene 79 3.1 YAC-Restriktionskarte 80 3.2 Genomische Restriktionskarte 85 3.3 Fusion der physikalischen Karten 88 3.4 Integration der genetischen Marker 88 4 Charakterisierung der cDNA-Sequenzen 90 4.1 Ermittlung der cDNA-Sequenzen 91 4.2 cDNA-Sequenzen bekannter EDC-Gene 91 4.3 cDNA-Sequenzen anderer bekannter Proteine 94 4.4 cDNA-Sequenzen unbekannter Funktion 94 IV DISKUSSION 102 1 Die Ressourcen 102 1.1 Das YAC-Contig des EDC 102 1.2 Die feingerasterte Keratinozyten-cDNA-Bibliothek 104 2 Die Hybridisierungsmethode 106 3 Die integrierte Karte der Region 1q21 108 4 Die neuen EDC-Gene 109 5 Der Genkomplex 116 5.1 EDC oder "CDC"? 116 5.2 Kontrolle der Genexpression 117 5.3 Orthologie im Mausgenom - der EDC der Maus 119 5.4 Paralogie im menschlichen Genom 121 6 Ausblicke 124 Va ZUSAMMENFASSUNG 126 Vb SUMMARY 128 Literaturverzeichnis 130 Publikationsliste 149

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2002/195/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	epidermal, differentiation, complex, EDC, 1q21, chromosome 1
DNB-Sachgruppe:	32 Biologie
Datum der Disputation:	02-Oct-2002
Entstanden am:	Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Prof. Dr. Andreas Ziegler
Zweiter Gutachter:	Prof. Dr. Volker A. Erdmann
Kontakt (Verfasser):	ingo.marenholz@kispi.unizh.ch
Kontakt (Betreuer):	andreas.ziegler@charite.de
Abgabedatum:	18-Sep-2002
Freigabedatum:	25-Sep-2002

 

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