FU Berlin Digitale Dissertation
Michael Heckelmann : Anreicherung und biochemische Charakterisierung einer Proteinacyltransferase (PAT) aus mikrosomalen Membranen Partial purification and biochemical characterization of a protein acyltransferase (PAT) from microsomal membranes
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung Hintergrund   Die S-Acylierung, eine hydrophobe, posttranslationale Proteinmodifikation, wurde in dieser Arbeit anhand verschiedener in-vitro-Experimente untersucht. Das Interesse lag dabei auf dem Mechanismus der Fettsäureübertragung bzw. der Enzymologie der Modi­fikation. Diese ist bisher noch weitestgehend ungeklärt. So war die Etablierung eines leistungs­fähigeren in-vitro-Systems zum Testen S-acylierender Aktivität mit dem Fernziel der Reinigung der PAT zentrales Anliegen der vorliegenden Arbeit. Die Etablierung neuer Enzymnachweise mit Peptiden und rekombi­nanten Proteinen als Akzeptoren diente zum einen dazu, neue ?tools? und Methoden für die Anreicherung zur Verfügung zu stellen, zum anderen konnte mit ihrer Hilfe die Palmitoylierung weiter charakterisiert werden. Der bioche­mischen und zellbiologischen Charakteri­sierung dienten auch die Lokalisationsversuche. Ergebnisse   (1.) An Zellulosemembranen gebundene Peptide, die der Acylierungsregion palmitoy­lierter Proteine entsprechen, ließen sich im in-vitro-PAT-Assay nicht als Akzep­toren verwen­den. Die Ergebnisse mit diesen Peptiden decken sich mit den in der Literatur beschriebenen in-vitro-Untersuchungen (Ba?ó et al., 1998). In diesen Untersuchungen fehlt jedoch der Vergleich mit den Original­proteinen, so daß ihre Aussagekraft aufgrund unserer Ergebnisse neu hinterfragt werden sollte. (2.) Es konnte weder mit dem in E.coli exprimierten Fusionsprotein GAP-43-GFP-His6 mit 10 AS des Aminoterminus noch mit dem ebenfalls in E.coli exprimierten Protein SNAP-25-His6 als Akzeptor ein in-vitro-PAT-Nachweis etabliert werden. Als Grund hierfür können die Fremdexpression in E.coli oder die Verkürzung der Akzeptorproteine sein, die eventuell den Verlust von Erkennungssignalen für die Palmitoylierung bewirken.  (3.) Die Anreicherung von PAT aus Mikrosomen humaner Plazenta wurde mit chromatographischen Methoden angestrebt. PAT Aktivität konnte mit nichtionischem Detergens TX-100 solubilisiert werden und mittels zwei säulenchromatographischer Anrei­che­rungsschritte (DEAE-Sepharose und blue-Sepharose) angereichert werden. Diese Aktivität erwies sich  aber als  äußerst labil und ließ sich nicht weiter aufreinigen (4.) Untersucht wurde die subzelluläre Verteilung der PAT-Aktivität, welche p59fyn palmitoyliert. Die Fraktionen Plasmamembran, Golgi-Apparat und endoplas­ma­tisches Reti­ku­lum aus Rattenlebergewebe wurden auf PAT-Aktivität untersucht. Es zeigte sich, daß die Aktivität für die eingesetzten Akzeptorproteine nur in Golgi- und Plasmamem­branen, nicht aber in endoplasmatischem Retikulum zu finden war. Weitere Experimente zeig­ten, daß sich die Solubilisierungs-Eigenschaften der membran­gebundenen Aktivi­täten in Plasmamembran und Golgi unterscheiden. Interpretation   Obwohl das Ziel einer Enzymreinigung nicht erreicht wurde, können die Ergebnisse dieser Arbeit einen Beitrag zur aktuellen Diskussion der Palmitoylierung liefern. Sie zeigen, daß die Wahl des Enzymnachweises von kritischer Bedeutung ist Die gewonnenen Daten stützen die Theorie eines enzyma­tischen Mechanismus der Fettsäureübertragung, da sie eine membranassoziierte S-Acylierungs-Aktivität zeigen, welche an Proteine gebunden zu sein scheint. Die subzelluläre Verteilung der Aktivität mit unterschiedlichen Solubilisierungs­eigen­schaften läßt vermuten, daß es sich dabei um unterschiedliche Enzyme einer Enzym-Familie handelt.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: Titelblatt und Inhaltverzeichnis 1. Einführung in die Thematik 11 1.1    Einleitung 11 1.2    Einordnung der S-Acylierung als hydrophobe Proteinmodifikation 11 1.3    Palmitoylierte Proteine 13 1.3.1       Glykopolypeptid E1 des Semliki Forest Virus 15 1.3.2       Tyrosinkinase p59fyn 16 1.3.3       Rhodopsin 17 1.3.4       GAP-43 / Neuromodulin 17 1.3.5       SNAP-25 18 1.4    Funktion der Palmitoylierung 19 1.5    Enzymatische versus nicht-enzymatische Palmitoylierung 22 1.6    Fettsäuren übertragende Enzymaktivitäten 24 1.7    Enzymtests: PAT-Assays 26 1.8    Akzeptoren für PAT-Assays 27 1.8.1         Rekombinante Proteine und Proteinreinigung über Hexahistidin       (His6) und Affinitätschromatographie mit komplex gebundenen Metallionen 27 1.8.2       Peptide als Akzeptorproteine 28 2. Problemstellung 29 3. Material und Methoden 30 3.1    Material 30 3.1.1       Chemikalien / Enzyme / ?Kits? 30 3.1.2       Zellinien / Viren / Gene / Gewebe 31 3.1.2.1          Zellinien 31 3.1.2.2          Viren 31 3.1.2.3          Gene / Plasmide 31 3.1.2.4          Gewebe 31 3.1.3       Besondere Geräte / Dokumentation 32 3.2    Methoden 33 3.2.1       Präparation der Akzeptoren 33 3.2.1.1          Präparation von E1-Glykoprotein aus der Hülle des Semliki Forest Virus 33 3.2.1.1.1             Gewinnung von Semliki Forest Viren 33 3.2.1.1.2             Präparation und Deacylierung der Glykoproteine E1 und E2 34 3.2.1.2          Herstellung rekombinanten GAP-43-GFP-His6 Fusionsproteins 34 3.2.1.2.1             Gentechnische Herstellung eines Vektors für die Proteinchimäre GAP-43-fyn-GFP-His6 34 3.2.1.2.1.1                Enzymatischer Verdau des Vektors und der cDNA des Fusionsproteins 35 3.2.1.2.1.2                Ligation der cDNA-Stücke 37 3.2.1.2.2             Herstellung kompetenter Zellen 37 3.2.1.2.3             Transformation der Bakterienzellen und Analyse der Umklonierung 37 3.2.1.2.4             Expression des GAP-43 - GFP-His6 Fusionsproteins in E.coli 38 3.2.1.2.5             Native Präparation des Fusionsproteins 38 3.2.1.3          Präparation rekombinanten SNAP-25 Proteins 39 3.2.1.3.1             Transformation von E.coli mit SNAP-25 Plasmiden 39 3.2.1.3.2             Expression von SNAP-25 Proteinen in E.coli 40 3.2.1.3.3             Native Reinigung der rekombinanten SNAP-25 Proteine 40 3.2.2       Präparation von [3H]-Palmitoyl-Coenzym A als Fettsäuresubstrat 41 3.2.2.1          Enzymatische Herstellung der [3H]-Pal-CoA 41 3.2.2.2          Untersuchung des Fettsäure-Derivats mit Hilfe von TLC 41 3.2.3       Präparation von PAT-Enzymquellen und Anreicherung der Enzymaktivität 42 3.2.3.1          PAT aus humaner Plazenta 42 3.2.3.1.1             Herstellung von Mikrosomen aus Plazenta 42 3.2.3.1.2             Membranextraktion mit Triton X-100 44 3.2.3.1.3             Chromatographische Anreicherung der PAT mit DEAE-Säule 45 3.2.3.1.4             Säulenchromatographie mit Blue Sepharose 45 3.2.3.2          Mikrosomen aus verschiedenen tierischen Geweben 45 3.2.3.3          Präparation verschiedener Membranfraktionen aus Rattenleber 46 3.2.3.4          Mikrosomenpräparationen aus Zellkulturen 49 3.2.4       PAT-Assays und Analysen 49 3.2.4.1          PAT- Assay mit SFV Glykoprotein E1 49 3.2.4.2          PAT-Assay mit auf Zellulosemembran immobilisierten Peptiden 50 3.2.4.3          PAT- Assay mit Rhodopsin 51 3.2.4.4          PAT- Assay mit fynSH432His6 und GAP-43-GFP-His6 51 3.2.4.5          PAT-Assay mit SNAP-25 Proteinen 51 3.2.4.6          Austesten verschiedener Membranfraktionen aus Rattenleber 52 3.2.4.7          Trypsinverdau der PAT-enthaltenden Mikrosomen 52 3.2.4.8           Testen des Einflusses von Trypsin auf PAT-Aktivität in Membranen 52 3.2.4.9           SDS-PAGE, Fluorographie, Phosphor-Imager Technik 52 4. Ergebnisse 54 4.1    PAT-Assay mit transmembranem Glykoprotein E1 aus Semliki Forest Virus 54 4.1.1       Präparation des deacylierten viralen Glykoproteins E1 54 4.1.2       Präparation von Tritium-markiertem Palmitoyl-CoA als Fettsäuresubstrat 55 4.2    Anreicherung spezifischer PAT-Aktivität 56 4.2.1       Anreicherung der PAT-Aktivität in Mikrosomen 57 4.2.2       Lokalisierung der PAT in den Mikrosomen mittels Trypsinverdau 59 4.2.3       Anreicherung der PAT-Aktivität durch Membranextraktion 61 4.2.4       Anreicherung der PAT-Aktivität durch Säulenchromatographie 61 4.2.4.1          DEAE-Sepharose 61 4.2.4.2          Blue-Sepharose Chromatographie 63 4.3    Entwicklung alternativer Enzymtests 63 4.3.1       PAT-Assay mit membrangebundenen synthetischen Peptiden 63 4.3.2       Rekombinantes Fusionsprotein GAP-43-GFP-His6 aus E.coli Expression 66 4.3.2.1          Expression und Reinigung von GAP-43-GFP-His6 und GFP-His6 66 4.3.2.2          PAT-Assay mit rekombinantem GAP-43-GFP-His6 68 4.3.3       Rekombinantes SNAP-25 70 4.3.3.1          Expression von SNAP-25 in E.coli und Reinigung des Proteins 70 4.3.3.2          PAT-Assay mit SNAP-25 71 4.4      Subzelluläre Lokalisation der Palmitoyl-Acyltransferase, die myristoyliertes    p59fyn palmitoyliert Retikulum und Plasmamenbran angereicherte Fraktionen 74 4.4.1         Trennung der Rattenleber in Golgi-Apparat, endoplasmatisches       Retikulum und Plasmamenbran angereicherte Fraktionen 74 4.4.2       Testen der Fraktionen auf PAT-Aktivität 74 4.4.3       Membranassoziation von PAT in Golgi-Apparat und Plasmamembran 75 4.4.4       Einfluß der Salzkonzentration auf die Extraktion von PAT-Aktivität aus den Membranen 76 5. Diskussion 78 5.1    Ausblick 88 6. Zusammenfassung 94 7. Summary 93 8. Literatur 95   Lebenslauf 112

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2002/230/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	Palmitoylation, S-acylation, protein acyltransferase, lipidation, PAT
DNB-Sachgruppe:	33 Medizin
Datum der Disputation:	13-Dec-2002
Entstanden am:	Fachbereich Humanmedizin, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Univ.-Prof. Dr. med. Werner Reutter
Zweiter Gutachter:	Priv.-Doz. Dr. Christian Harteneck
Kontakt (Verfasser):	michael@my-heckelmann.de
Kontakt (Betreuer):	reutter@medizin.fu-berlin.de
Abgabedatum:	07-Nov-2002
Freigabedatum:	27-Nov-2002

|| DARWIN|| Digitale Dissertationen || Dissertation|| English Version|| FU Berlin|| Seitenanfang ||

	Fragen und Kommentare an: darwin@inf.fu-berlin.de
© Freie Universität Berlin 1999