FU Berlin Digitale Dissertation
Michael Heckelmann : Partial purification and biochemical characterization of a protein acyltransferase (PAT) from microsomal membranes Anreicherung und biochemische Charakterisierung einer Proteinacyltransferase (PAT) aus mikrosomalen Membranen
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Abstract Background   This work describes the investigation of protein S-acylation as a hydrophobic posttranslational modification by different in vitro experiments. The main interest was on the mechanism of fatty acid transfer onto the protein with a special emphasis on the enzymology of the modification, which still remains mostly unknown. In order to find evidence for an enzymatic process it will be necessary to isolate and identify an enzyme at the molecular level. In this regard purifying an enzyme with protein fatty acyl transferase (PAT) activity was the aim of this work. Establishing an enzyme assay using peptides and recombinant proteins as substrates for PAT, the central focus of the investigations, served both to develop new tools for purifying PAT and to further characterize S-acylation. Biochemical and cell biological characterizations were also gained from the experiments which aimed for localizing the enzyme within the cell and cell membranes. Results  (1.) Immobilized peptides which mimic sequences of palmitoylated proteins did not function as substrates (fatty acid acceptors) in the tested in vitro PAT-assays. Palmitoyl-CoA was transferred onto these synthetic peptides but the results did not match the results given in experiments with the corresponding protein.  The results agree with in vitro PAT assays described in literature (Ba?ó et al., 1998). But for this investigation there is no comparison to the original protein which questions their meaningfulness in site of our results. (2.) No in vitro PAT-assay was established using SNAP-25-His6 or GAP43-GFP-His6 recombinant proteins expressed in E.coli as substrates. So we hypothesize that the expression of the 10 amino acid fusion protein in E. coli is not sufficient to confer palmitoylation. (3.) In the purification process of the PAT-enzyme from human placenta microsomes, we were able to advance the purification by adding further chromatographic steps (DEAE fast flow and blue-Sepharose). After these steps the activity was very labile which prevented further purification. (4.) The investigation of the subcellular distribution of PAT-activity which palmitoylates p59fyn gave interesting results. Only Golgi and plasma membrane showed PAT activity towards the Fyn substrate and not the endoplasmic reticulum. Further comparison revealed differences in the solubility of the activity from plasma membrane and Golgi. Interpretation   Even though the goal of purifying the PAT enzyme to a single band as analyzed by electrophoresis was not reached, the reported results of this research contributes new scientific information on the ongoing investigations of palmitoylation. They show that the choice of enzymatic assays plays a critical role and that the comparison of the synthetic substrate to the original or native protein is an important control to critically assess biochemical palmitoylation data. In the data provided by our results the membrane bound PAT-activity shows characteristics of a protein related, enzymatic activity. Therefore it supports the theory of an enzymatic mechanism of palmitoylation. The various subcellular distributions of PAT activity and the difference in the solubilization properties of these PAT activities suggest the existence of different members of a PAT family.

Table of Contents Download the whole PhDthesis as a zip-tar file or as zip-File For download in PDF format click the chapter title Titelblatt und Inhaltverzeichnis 1. Einführung in die Thematik 11 1.1    Einleitung 11 1.2    Einordnung der S-Acylierung als hydrophobe Proteinmodifikation 11 1.3    Palmitoylierte Proteine 13 1.3.1       Glykopolypeptid E1 des Semliki Forest Virus 15 1.3.2       Tyrosinkinase p59fyn 16 1.3.3       Rhodopsin 17 1.3.4       GAP-43 / Neuromodulin 17 1.3.5       SNAP-25 18 1.4    Funktion der Palmitoylierung 19 1.5    Enzymatische versus nicht-enzymatische Palmitoylierung 22 1.6    Fettsäuren übertragende Enzymaktivitäten 24 1.7    Enzymtests: PAT-Assays 26 1.8    Akzeptoren für PAT-Assays 27 1.8.1         Rekombinante Proteine und Proteinreinigung über Hexahistidin       (His6) und Affinitätschromatographie mit komplex gebundenen Metallionen 27 1.8.2       Peptide als Akzeptorproteine 28 2. Problemstellung 29 3. Material und Methoden 30 3.1    Material 30 3.1.1       Chemikalien / Enzyme / ?Kits? 30 3.1.2       Zellinien / Viren / Gene / Gewebe 31 3.1.2.1          Zellinien 31 3.1.2.2          Viren 31 3.1.2.3          Gene / Plasmide 31 3.1.2.4          Gewebe 31 3.1.3       Besondere Geräte / Dokumentation 32 3.2    Methoden 33 3.2.1       Präparation der Akzeptoren 33 3.2.1.1          Präparation von E1-Glykoprotein aus der Hülle des Semliki Forest Virus 33 3.2.1.1.1             Gewinnung von Semliki Forest Viren 33 3.2.1.1.2             Präparation und Deacylierung der Glykoproteine E1 und E2 34 3.2.1.2          Herstellung rekombinanten GAP-43-GFP-His6 Fusionsproteins 34 3.2.1.2.1             Gentechnische Herstellung eines Vektors für die Proteinchimäre GAP-43-fyn-GFP-His6 34 3.2.1.2.1.1                Enzymatischer Verdau des Vektors und der cDNA des Fusionsproteins 35 3.2.1.2.1.2                Ligation der cDNA-Stücke 37 3.2.1.2.2             Herstellung kompetenter Zellen 37 3.2.1.2.3             Transformation der Bakterienzellen und Analyse der Umklonierung 37 3.2.1.2.4             Expression des GAP-43 - GFP-His6 Fusionsproteins in E.coli 38 3.2.1.2.5             Native Präparation des Fusionsproteins 38 3.2.1.3          Präparation rekombinanten SNAP-25 Proteins 39 3.2.1.3.1             Transformation von E.coli mit SNAP-25 Plasmiden 39 3.2.1.3.2             Expression von SNAP-25 Proteinen in E.coli 40 3.2.1.3.3             Native Reinigung der rekombinanten SNAP-25 Proteine 40 3.2.2       Präparation von [3H]-Palmitoyl-Coenzym A als Fettsäuresubstrat 41 3.2.2.1          Enzymatische Herstellung der [3H]-Pal-CoA 41 3.2.2.2          Untersuchung des Fettsäure-Derivats mit Hilfe von TLC 41 3.2.3       Präparation von PAT-Enzymquellen und Anreicherung der Enzymaktivität 42 3.2.3.1          PAT aus humaner Plazenta 42 3.2.3.1.1             Herstellung von Mikrosomen aus Plazenta 42 3.2.3.1.2             Membranextraktion mit Triton X-100 44 3.2.3.1.3             Chromatographische Anreicherung der PAT mit DEAE-Säule 45 3.2.3.1.4             Säulenchromatographie mit Blue Sepharose 45 3.2.3.2          Mikrosomen aus verschiedenen tierischen Geweben 45 3.2.3.3          Präparation verschiedener Membranfraktionen aus Rattenleber 46 3.2.3.4          Mikrosomenpräparationen aus Zellkulturen 49 3.2.4       PAT-Assays und Analysen 49 3.2.4.1          PAT- Assay mit SFV Glykoprotein E1 49 3.2.4.2          PAT-Assay mit auf Zellulosemembran immobilisierten Peptiden 50 3.2.4.3          PAT- Assay mit Rhodopsin 51 3.2.4.4          PAT- Assay mit fynSH432His6 und GAP-43-GFP-His6 51 3.2.4.5          PAT-Assay mit SNAP-25 Proteinen 51 3.2.4.6          Austesten verschiedener Membranfraktionen aus Rattenleber 52 3.2.4.7          Trypsinverdau der PAT-enthaltenden Mikrosomen 52 3.2.4.8           Testen des Einflusses von Trypsin auf PAT-Aktivität in Membranen 52 3.2.4.9           SDS-PAGE, Fluorographie, Phosphor-Imager Technik 52 4. Ergebnisse 54 4.1    PAT-Assay mit transmembranem Glykoprotein E1 aus Semliki Forest Virus 54 4.1.1       Präparation des deacylierten viralen Glykoproteins E1 54 4.1.2       Präparation von Tritium-markiertem Palmitoyl-CoA als Fettsäuresubstrat 55 4.2    Anreicherung spezifischer PAT-Aktivität 56 4.2.1       Anreicherung der PAT-Aktivität in Mikrosomen 57 4.2.2       Lokalisierung der PAT in den Mikrosomen mittels Trypsinverdau 59 4.2.3       Anreicherung der PAT-Aktivität durch Membranextraktion 61 4.2.4       Anreicherung der PAT-Aktivität durch Säulenchromatographie 61 4.2.4.1          DEAE-Sepharose 61 4.2.4.2          Blue-Sepharose Chromatographie 63 4.3    Entwicklung alternativer Enzymtests 63 4.3.1       PAT-Assay mit membrangebundenen synthetischen Peptiden 63 4.3.2       Rekombinantes Fusionsprotein GAP-43-GFP-His6 aus E.coli Expression 66 4.3.2.1          Expression und Reinigung von GAP-43-GFP-His6 und GFP-His6 66 4.3.2.2          PAT-Assay mit rekombinantem GAP-43-GFP-His6 68 4.3.3       Rekombinantes SNAP-25 70 4.3.3.1          Expression von SNAP-25 in E.coli und Reinigung des Proteins 70 4.3.3.2          PAT-Assay mit SNAP-25 71 4.4      Subzelluläre Lokalisation der Palmitoyl-Acyltransferase, die myristoyliertes    p59fyn palmitoyliert Retikulum und Plasmamenbran angereicherte Fraktionen 74 4.4.1         Trennung der Rattenleber in Golgi-Apparat, endoplasmatisches       Retikulum und Plasmamenbran angereicherte Fraktionen 74 4.4.2       Testen der Fraktionen auf PAT-Aktivität 74 4.4.3       Membranassoziation von PAT in Golgi-Apparat und Plasmamembran 75 4.4.4       Einfluß der Salzkonzentration auf die Extraktion von PAT-Aktivität aus den Membranen 76 5. Diskussion 78 5.1    Ausblick 88 6. Zusammenfassung 94 7. Summary 93 8. Literatur 95   Lebenslauf 112

More Information:
Online available:	http://www.diss.fu-berlin.de/2002/230/indexe.html
Language of PhDThesis:	german
Keywords:	Palmitoylation, S-acylation, protein acyltransferase, lipidation, PAT
DNB-Sachgruppe:	33 Medizin
Date of disputation:	13-Dec-2002
PhDThesis from:	Fachbereich Humanmedizin, Freie Universität Berlin
First Referee:	Univ.-Prof. Dr. med. Werner Reutter
Second Referee:	Priv.-Doz. Dr. Christian Harteneck
Contact (Author):	michael@my-heckelmann.de
Contact (Advisor):	reutter@medizin.fu-berlin.de
Date created:	07-Nov-2002
Date available:	27-Nov-2002

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