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FU Berlin
Digitale Dissertation

Niels Henrik Gehring :
Posttranskriptionale Veränderungen der Genexpression bei hereditären Erkrankungen
Posttranscriptional changes of gene expression in hereditary diseases

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

Krankheitsverursachende Mutationen befinden sich häufig innerhalb des offenen Leserahmens von mRNAs, wo sie Struktur und Funktion des gebildeten Proteins beeinflussen. Eine Reihe von hereditären Erkrankungen wird jedoch nicht durch Mutationen hervorgerufen, die solche offensichtlichen Auswirkungen haben, sondern verschiedene Schritte des mRNA-Metabolismus verändern. In dieser Arbeit wurden am Beispiel zweier krankheitsverursachender Mutationen posttranskriptionale Mechanismen der Genexpressionsveränderung untersucht. Im ersten Teil wurde der molekulare Mechanismus der Prothrombin 20210 G>A Mutation untersucht. Diese Mutation stellt einen der häufigsten genetischen Risikofaktoren für das Auftreten von Thrombosen dar und betrifft etwa 1-2% der Bevölkerung. Die G>A Transition verändert das letzte Nukleotid der 3'UTR der mRNA und verursacht erhöhte Prothrombin-Plasmakonzentrationen, die eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der Krankheit spielen. Meine Untersuchungen zeigen, daß die G>A Mutation eine verstärkte Verwendung der 3'End-Prozessierungsstelle bewirkt, da das normale Prothrombin 3'End-Prozessierungs-signal ineffizient erkannt wird. Dies resultiert in einer vermehrten Akkumulation von korrekt 3'End-prozessierter mRNA im Zytoplasma, die in Protein translatiert werden kann. Diese erhöhte Effizienz der 3'End-Prozessierung stellt einen neuartigen molekularen Mechanismus einer hereditären Erkrankung dar und erklärt die Rolle der Prothrombin 20210 G>A Mutation bei der Pathogenese von Thrombosen. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit eindrücklich wie bereits eine nur geringe Abweichung der mRNA-Prozessierung für eine verbreitete und gefährliche Krankheit prädisponieren kann. Im zweiten Teil wurde der Nonsens-vermittelte mRNA-Abbau (NMD), ein hoch-konservierter Mechanismus der posttranskriptionalen mRNA-Qualitäts-kontrolle untersucht. Dieser Mechanismus, der zum raschen Abbau von Nonsens-mutierten mRNAs führt, spielt als modifizierender Faktor eine wichtige Rolle bei zahlreichen hereditären Erkrankungen. Besonders gut belegt ist dieser Effekt des NMD bei Nonsens-Mutationen des β-Globins die zur β-Thalassämie führen. Das β-Globin-Gen diente auch in dieser Arbeit zur Analyse von funktionellen Charakteristika des NMD. Untersuchungen zur Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim NMD zeigten eindeutig, daß der humane NMD poly(A)-unabhängig stattfindet. Weiterhin wurde ein experimentelles System entwickelt um Faktoren des humanen NMD zu identifizieren und charakterisieren. Diverse Deletions-mutanten des humanen NMD-Faktors hUpf3b wurden in diesem System auf ihre NMD-Aktivierung untersucht. Es zeigte sich, daß eine Region, die nachfolgend als Y14 Bindungsstelle identifiziert wurde, eine essentielle Rolle für die NMD-Funktion von hUpf3b spielt. Dies implizierte eine Funktion von Y14 beim NMD. Daher wurde die Wirkung von Y14 im experimentellen System untersucht, was zu einer außergewöhnlich starken Aktivierung des NMD führte. Zusammen definieren diese Experimente also eine wichtige Rolle von Y14 beim humanen NMD. Die durch diese Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Veränderung der Genexpression bei hereditären Erkrankungen liefern einen wichtigen Beitrag zum generellen Verständnis von Auswirkungen krankheitsverursachender Mutationen auf Schritte des mRNA-Stoffwechsels. Zusätzlich werden die Ergebnisse einen wesentlichen Einfluß auf zukünftige Untersuchungen der molekularen Pathogenese verschiedener Erbkrankheiten ausüben.

Inhaltsverzeichnis

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TITEL UND INHALT 1
1 EINLEITUNG 6
1.1 Die Bedeutung des humanen Genoms 6
1.2 Kontrolle der Genexpression 9
1.2.1 Das Konzept eines regulierten Transkripts 10
1.3 Die Blutgerinnung 15
1.3.1 Kontrolle der Blutgerinnung 17
1.3.2 Hereditäre Störungen der Blutgerinnung 17
1.4 Nonsens-vermittelter mRNA-Abbau 19
1.4.1 Modelle des NMD 20
1.4.2 Die Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim NMD 23
1.4.3 Die Komponenten des NMD beim Menschen 25
2 ABKÜRZUNGEN 28
3 MATERIAL UND METHODEN 31
3.1 Mikrobiologische Methoden 31
3.1.1 Bakterienstämme 31
3.1.2 Phagen 31
3.1.3 Herstellung elektrokompetenter Bakterien und Elektroporation 31
3.2 Kultur eukaryontischer Zellen 32
3.3 Transfektion eukaryontischer Zellen 32
3.3.1 BBS/Kalziumphosphat Methode 32
3.3.2 HBS/Kalziumphosphat Methode 33
3.4 Plasmid-Konstrukte 34
3.5 In vitro Mutagenese 39
3.5.1 PCR in vitro Mutagenese 40
3.5.2 In vitro Mutagenese mit Uracil-haltiger einzelsträngiger DNA 40
3.6 Sequenzierung von DNA 41
3.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen 42
3.8 Plasmid-Präparation im Mini-Maßstab 42
3.9 Plasmid-Präparation im Midi-, Maxi- und Mega-Maßstab 42
3.10 RNA-Präparation aus eukaryontischen Zellen 42
3.10.1 Präparation von zytoplasmatischer Gesamt-RNA 42
3.10.2 Präparation nukleärer Gesamt-RNA 43
3.10.3 Fraktionierung von zytoplasmatischer Gesamt-RNA in poly(A)-angereicherte und poly(A)-abgereicherte RNA 43
3.11 Ribonuklease-Protektions-Analyse 43
3.12 RNA-Analyse mittels Northern-Blot 45
3.13 In vitro Transkription 46
3.14 Primer-Extension-Analyse 47
3.14.1 Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden 48
3.15 LM-PAT-Assay 48
3.16 RT-PCR 49
3.17 Proteinextraktion 49
3.17.1 Proteinbestimmung 50
3.18 Immunpräzipitation 50
3.19 Protein-Analyse mittels Immunblot 50
3.20 Puffer und Lösungen 51
3.21 Medien für Bakterienkultur 54
3.22 Reagenzien und Materialien 55
3.22.1 Chemikalien 55
3.22.2 Antikörper 56
3.22.3  Laborkunststoffwaren 56
3.22.4 Enzyme 56
4 ERGEBNISSE 57
4.1 Untersuchung des molekularen Mechanismus der Prothrombin 20210 G>A Mutation 57
4.1.1 Experimentelles System 58
4.1.2 Die F2 20210 G>A Mutation führt zu erhöhter mRNA- und Protein-Akkumulation 59
4.1.3 Die F2 20210 G>A Mutation erhöht die mRNA Expression auf post-transkriptionaler Ebene 60
4.1.4 F2*A und F2*G mRNAs weisen identische Poly(A)-Schwänze und 3?UTRs auf 63
4.1.5 Die Mutation F2 20210 G>A bewirkt eine Erhöhung der 3'End-Prozessierungs-effizienz 65
4.2 Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim Nonsens-vermittelten mRNA-Abbau 69
4.2.1 Experimentelles System 70
4.2.2 Hybrid-mRNAs aus HBB und H1F3 werden korrekt am 3?Ende prozessiert 71
4.2.3 Hybrid-mRNAs bilden funktionelle Histon 3?Enden 74
4.2.4 Demonstration der eisenabhängigen Translationsregulation im experimentellen System 75
4.2.5 Nicht-polyadenylierte Hybrid-mRNAs mit Histon 3?Enden unterliegen dem Nonsens-vermittelten mRNA-Abbau 77
4.2.6 Die verringerte Expression der Nonsens-mutierten Hybrid-mRNAs ist spleißabhängig 80
4.3 Charakterisierung von Komponenten des Nonsens-vermittelten mRNA-Abbaus

84
4.3.1 Das experimentelle lambdaN/boxB beta-Globin-System 85
4.3.2 Untersuchung potentieller NMD-Faktoren 92
4.3.3 Funktionelle Analyse von Deletionsmutanten von hUpf3b 92
4.3.4 Punktmutationen im Bereich 421-434 interferieren mit der NMD-Wirkung von hUpf3b 97
4.3.5 Der C-Terminus von hUpf3b ist notwendig aber nicht hinreichend um NMD zu vermitteln 98
4.3.6 Die Aminosäuren 421-434 von hUpf3b vermitteln die Interaktion mit Y14 101
4.3.7 Y14 ist ein starker Vermittler von NMD 103
4.3.8 Y14 ist ein bona fide Mediator des NMD 104
5 DISKUSSION 107
5.1 Untersuchung des molekularen Mechanismus der Prothrombin 20210 G>A Mutation 107
5.1.1 Ein neuartiger Mechanismus einer hereditären Erkrankung 107
5.1.2 Auswirkungen der 3?End-Prozessierungseffizienz auf die Prothrombin-Expression 109
5.1.3 Fazit 109
5.1.4 Ausblick 110
5.2 Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim Nonsens-vermittelten mRNA-Abbau 112
5.2.1 Die Kopplung der Polyadenylierung und anderer RNA-Prozessierungsreaktionen 114
5.2.2 Fazit 114
5.2.3 Ausblick 114
5.3 Charakterisierung von Komponenten des Nonsens-vermittelten mRNA-Abbaus 115
5.3.1 Charakterisierung von hUpf3b-Domänen im NMD 118
5.3.2 Identifizierung von Y14 als bona fide NMD-Mediator 120
5.3.3 Fazit 121
5.3.4 Ausblick 121
6 ZUSAMMENFASSUNG 125
7 SUMMARY 127
8 BIBLIOGRAPHIE 129

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/248/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: gene expression, mRNA, hereditary disease
DNB-Sachgruppe: 32 Biologie
Datum der Disputation: 24-Oct-2002
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: Prof. Dr. Andreas Kulozik
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Volker Erdmann
Kontakt (Verfasser): niels_gehring@med.uni-heidelberg.de
Kontakt (Betreuer): andreas_kulozik@med.uni-heidelberg.de
Abgabedatum:20-Nov-2002
Freigabedatum:26-Nov-2002

 

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