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FU Berlin
Digitale Dissertation

Niels Henrik Gehring :
Posttranscriptional changes of gene expression in hereditary diseases
Posttranskriptionale Veränderungen der Genexpression bei hereditären Erkrankungen

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Abstract

Disease-causing mutations are commonly located within the open reading frames of mRNAs and are likely to affect the protein structure and function. However, several hereditary diseases do not result from mutations which exert these obvious effects, but have been shown to influence various steps of mRNA metabolism. In this study two examples of disease-producing mutations have been used to investigate post-transcriptional mechanisms affecting gene expression. In the first part of this thesis, the molecular mechanism underlying the prothrombin 20210 G>A mutation has been elucidated. This mutation represents a very common genetic risk factor for the occurrence of thromboses and affects 1-2% of the European population. The G>A transition is located at the last nucleotide of the 3'UTR of the mRNA and causes elevated prothrombin plasma levels, which are thought to play an important role in the pathogenesis of the disease. Here I show, that the normal prothrombin 3'end processing signal is inefficiently recognised and that the G>A transition is a gain of function mutation causing an increase of processing site usage. This results in an elevation of correctly 3'end processed mRNA accumulation in the cytoplasm and increased protein synthesis. Enhanced mRNA 3?end formation efficiency emerges as a novel molecular principle causing a hereditary disease and explains the role of the prothrombin 20210 G>A mutation in the pathogenesis of thrombosis. Furthermore this work also represents a striking example of how a quantitatively minor aberration of mRNA processing can predispose to a common and serious disease. A highly conserved mRNA quality-control mechanism referred to as nonsense-mediated mRNA decay has been investigated in the second part of this thesis. This mechanism, which leads to the rapid degradation of nonsense-mutated mRNA, plays an important role as a modifying factor in a number of hereditary diseases. The important role of the NMD-pathway is exemplified by mutations in the β-globin gene, leading to β-thalassemia. The β-globin gene was also used in this study to analyse functional characteristics of the NMD. Experiments adressing the role of the poly(A) tail for the NMD-pathway showed, that human NMD occurs poly(A) independent. Furthermore, an experimental system has been developed to identify and characterise protein factors involved in human NMD. A number of deletion mutants of the human NMD-factor hUpf3b were created and tested for their ability to elicit NMD in this system. This approach showed that a sequence, subsequently identified as Y14 interaction site, played an essential role for the NMD-activation by hUpf3b. This indicated an NMD function of Y14. In further experiments, direct analysis of Y14 resulted in a dramatic NMD-activation. Together, these experiments define an important role of Y14 in the human NMD-pathway. In summary, these results provide an important contribution to our general understanding of effects of disease-causing mutations on various steps of the mRNA-metabolism. Furthermore they will have a remarkable impact on future investigations of the molecular pathogenesis of hereditary diseases.

Table of Contents

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TITEL UND INHALT 1
1 EINLEITUNG 6
1.1 Die Bedeutung des humanen Genoms 6
1.2 Kontrolle der Genexpression 9
1.2.1 Das Konzept eines regulierten Transkripts 10
1.3 Die Blutgerinnung 15
1.3.1 Kontrolle der Blutgerinnung 17
1.3.2 Hereditäre Störungen der Blutgerinnung 17
1.4 Nonsens-vermittelter mRNA-Abbau 19
1.4.1 Modelle des NMD 20
1.4.2 Die Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim NMD 23
1.4.3 Die Komponenten des NMD beim Menschen 25
2 ABKÜRZUNGEN 28
3 MATERIAL UND METHODEN 31
3.1 Mikrobiologische Methoden 31
3.1.1 Bakterienstämme 31
3.1.2 Phagen 31
3.1.3 Herstellung elektrokompetenter Bakterien und Elektroporation 31
3.2 Kultur eukaryontischer Zellen 32
3.3 Transfektion eukaryontischer Zellen 32
3.3.1 BBS/Kalziumphosphat Methode 32
3.3.2 HBS/Kalziumphosphat Methode 33
3.4 Plasmid-Konstrukte 34
3.5 In vitro Mutagenese 39
3.5.1 PCR in vitro Mutagenese 40
3.5.2 In vitro Mutagenese mit Uracil-haltiger einzelsträngiger DNA 40
3.6 Sequenzierung von DNA 41
3.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen 42
3.8 Plasmid-Präparation im Mini-Maßstab 42
3.9 Plasmid-Präparation im Midi-, Maxi- und Mega-Maßstab 42
3.10 RNA-Präparation aus eukaryontischen Zellen 42
3.10.1 Präparation von zytoplasmatischer Gesamt-RNA 42
3.10.2 Präparation nukleärer Gesamt-RNA 43
3.10.3 Fraktionierung von zytoplasmatischer Gesamt-RNA in poly(A)-angereicherte und poly(A)-abgereicherte RNA 43
3.11 Ribonuklease-Protektions-Analyse 43
3.12 RNA-Analyse mittels Northern-Blot 45
3.13 In vitro Transkription 46
3.14 Primer-Extension-Analyse 47
3.14.1 Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden 48
3.15 LM-PAT-Assay 48
3.16 RT-PCR 49
3.17 Proteinextraktion 49
3.17.1 Proteinbestimmung 50
3.18 Immunpräzipitation 50
3.19 Protein-Analyse mittels Immunblot 50
3.20 Puffer und Lösungen 51
3.21 Medien für Bakterienkultur 54
3.22 Reagenzien und Materialien 55
3.22.1 Chemikalien 55
3.22.2 Antikörper 56
3.22.3  Laborkunststoffwaren 56
3.22.4 Enzyme 56
4 ERGEBNISSE 57
4.1 Untersuchung des molekularen Mechanismus der Prothrombin 20210 G>A Mutation 57
4.1.1 Experimentelles System 58
4.1.2 Die F2 20210 G>A Mutation führt zu erhöhter mRNA- und Protein-Akkumulation 59
4.1.3 Die F2 20210 G>A Mutation erhöht die mRNA Expression auf post-transkriptionaler Ebene 60
4.1.4 F2*A und F2*G mRNAs weisen identische Poly(A)-Schwänze und 3?UTRs auf 63
4.1.5 Die Mutation F2 20210 G>A bewirkt eine Erhöhung der 3'End-Prozessierungs-effizienz 65
4.2 Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim Nonsens-vermittelten mRNA-Abbau 69
4.2.1 Experimentelles System 70
4.2.2 Hybrid-mRNAs aus HBB und H1F3 werden korrekt am 3?Ende prozessiert 71
4.2.3 Hybrid-mRNAs bilden funktionelle Histon 3?Enden 74
4.2.4 Demonstration der eisenabhängigen Translationsregulation im experimentellen System 75
4.2.5 Nicht-polyadenylierte Hybrid-mRNAs mit Histon 3?Enden unterliegen dem Nonsens-vermittelten mRNA-Abbau 77
4.2.6 Die verringerte Expression der Nonsens-mutierten Hybrid-mRNAs ist spleißabhängig 80
4.3 Charakterisierung von Komponenten des Nonsens-vermittelten mRNA-Abbaus

84
4.3.1 Das experimentelle lambdaN/boxB beta-Globin-System 85
4.3.2 Untersuchung potentieller NMD-Faktoren 92
4.3.3 Funktionelle Analyse von Deletionsmutanten von hUpf3b 92
4.3.4 Punktmutationen im Bereich 421-434 interferieren mit der NMD-Wirkung von hUpf3b 97
4.3.5 Der C-Terminus von hUpf3b ist notwendig aber nicht hinreichend um NMD zu vermitteln 98
4.3.6 Die Aminosäuren 421-434 von hUpf3b vermitteln die Interaktion mit Y14 101
4.3.7 Y14 ist ein starker Vermittler von NMD 103
4.3.8 Y14 ist ein bona fide Mediator des NMD 104
5 DISKUSSION 107
5.1 Untersuchung des molekularen Mechanismus der Prothrombin 20210 G>A Mutation 107
5.1.1 Ein neuartiger Mechanismus einer hereditären Erkrankung 107
5.1.2 Auswirkungen der 3?End-Prozessierungseffizienz auf die Prothrombin-Expression 109
5.1.3 Fazit 109
5.1.4 Ausblick 110
5.2 Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim Nonsens-vermittelten mRNA-Abbau 112
5.2.1 Die Kopplung der Polyadenylierung und anderer RNA-Prozessierungsreaktionen 114
5.2.2 Fazit 114
5.2.3 Ausblick 114
5.3 Charakterisierung von Komponenten des Nonsens-vermittelten mRNA-Abbaus 115
5.3.1 Charakterisierung von hUpf3b-Domänen im NMD 118
5.3.2 Identifizierung von Y14 als bona fide NMD-Mediator 120
5.3.3 Fazit 121
5.3.4 Ausblick 121
6 ZUSAMMENFASSUNG 125
7 SUMMARY 127
8 BIBLIOGRAPHIE 129

More Information:

Online available: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/248/indexe.html
Language of PhDThesis: german
Keywords: gene expression, mRNA, hereditary disease
DNB-Sachgruppe: 32 Biologie
Date of disputation: 24-Oct-2002
PhDThesis from: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
First Referee: Prof. Dr. Andreas Kulozik
Second Referee: Prof. Dr. Volker Erdmann
Contact (Author): niels_gehring@med.uni-heidelberg.de
Contact (Advisor): andreas_kulozik@med.uni-heidelberg.de
Date created:20-Nov-2002
Date available:26-Nov-2002

 

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