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FU Berlin
Digitale Dissertation

Ulf Thomas :
Die Rolle der Proteinkinase C bei der Bildung von Langzeitgedächtnis
Interaktion der PKC mit Ankerproteinen im Pilzkörper der Honigbiene Apis mellifera
Function of protein kinase C in the formation of long-term memory

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|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung

  In dieser Arbeit wurde die Rolle der Protein Kinase C (PKC) bei nicht-assoziativen und assoziativen Lernformen der Honigbiene Apis mellifera untersucht. Mit Hilfe spezifischer Inhibitoren für die PKC bzw. deren katalytisches Fragment PKM konnte die Funktion dieser Enzyme in Verhaltensversuchen untersucht werden. Die Inhibition der PKC-Aktivität hatte keinen Einfluss auf nicht-assoziative Lernformen wie Habituation oder Sensitisierung. Beim assoziativen olfaktorischen Lernen zeigte sich, dass nur die Inhibition der PKC, jedoch nicht die Blockierung der PKM zu Defekten bei der Gedächtnisbildung führte. Die Aktivität der PKC ist dabei nur in einem kurzen Zeitfenster von 1 - 2 Stunden nach der Konditionierung für die Gedächtnisbildung notwendig. Die Untersuchungen der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zeigten, dass sich die Menge der membrangebundenen PKC aus den Pilzkörpern durch das assoziative Lernen veränderte. Unter Verwendung von Antikörpern wurde zum gleichen Zeitpunkt (1-2 h nach der Konditionierung) zu dem die Aktivität der PKC für die Gedächtnisbildung benötigt wurde, eine Reduktion der PKC-Menge beobachtet. Mit Hilfe von Harnstoff und Trypsin konnte nachgewiesen werden, dass es sich nicht um eine wirkliche Abnahme der PKC-Menge, sondern um eine Maskierung der Antikörperbindestelle handelte. Diese Maskierung beruhte auf der Interaktion der PKC mit anderen Proteinen. Die Interaktion und Komplexierung der PKC wurde durch die Inhibition der PKC-Aktivität, welche zu einer Reduktion bei der Gedächtnisbildung führte, ebenfalls verhindert. Diese Ergebnisse zeigten, dass PKC in den Pilzkörper 1 ? 2 Stunden nach der olfaktorischen Konditionierung mit anderen Proteinen interagiert und Komplexe bildet, und dass dieser Prozess an der Bildung von Langzeitgedächtnis beteiligt ist. Um erste Hinweise auf mögliche Interaktionspartner der PKC zu erhalten, erfolgte ein Vergleich der Aminosäuresequenzen bekannter PKC Bindeproteinen mit einer Proteindatenbank der Biene. Mit einem RACK1 ähnliche Protein wurde in der Biene ein PKC Bindeprotein gefunden, dass alle Kriterien für die beobachtete Interaktion mit PKC bei der Gedächtnisbildung erfüllt. Der immunhistologische Nachweis von dem RACK1 ähnlichen Protein zeigte, dass es vor allem in den Kenyonzellen der Pilzkörper und den Antennallobuszellen expremiert wird. Innerhalb der Kalyzes konnte dabei eine deutlich höhere Immunreaktivität im Kern gegenüber dem Zytosol beobachtet werden. Durch eine Immunpräzipitation wurde nachgewiesen, dass aktivierte PKC an das RACK1 ähnliche Protein der Biene bindet. Somit wurde erstmals eine Interaktion der Proteinkinase C mit Ankerproteinen im Gehirn der Honigbiene nachgewiesen. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass diese Interaktion eine zentrale Rolle bei Prozessen der Gedächtnisbildung spielen.

Inhaltsverzeichnis

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0. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 6
1.1 Lernen und neuronale Plastizität 6
1.1.1 Nicht-assoziative und assoziative Lernformen 6
1.1.2 Modellsysteme für die Untersuchung von Lern- und Gedächtnisphasen 8
1.1.3 Molekulare Mechanismen von Lernen und Gedächtnis 12
1.2 Protein Kinase C 15
1.2.1 Die PKC-Familie: Einteilung und Aktivatoren 15
1.2.2 Aktivierungsmechanismen der PKC 16
1.2.3 Substrate und Funktionen von neuronaler PKC 17
1.3 Ziel dieser Arbeit 18
2. Material und Methoden 20
2.1 Methoden 20
2.1.1 Vorbereitung der Versuchstiere 20
2.1.1.1 Habituation und Dishabituation 20
2.1.1.2 Sensitisierung 21
2.1.1.3 Olfaktorische Konditionierung 21
2.1.1.4 Injektion der Pharmaka 21
2.1.2 Immunchemische und immunhistologische Techniken 22
2.1.2.1 Präparation der Pilzkörper 22
2.1.2.2 Immunhistologie 23
2.1.2.3 Proteinquantifizierung mittels ELISA-Technik (Enzyme linked sorbent assay) 24
2.1.2.4 Westernblot 25
2.1.2.5 Immunpräzipitation 26
2.1.3 Bestimmung der Proteinkinase-Aktivität 27
2.1.4 Diskontinuierliche Gelelektrophorese 29
2.2 Material 30
2.2.1 Puffer und Lösungen 30
2.2.2 Chemikalien 32
2.2.3 Antikörper und Enzyme 33
2.2.4 Verbrauchsmaterialien 34
2.2.5 Geräte 34
3. Ergebnisse 35
3.1 Etablierung von Methoden zur Messung und Inhibition von PKC- und PKM-Aktivität 35
3.1.1 Die PKC-Gesamtaktivität kann nicht auf die PKC-Isoformen unterteilt werden 35
3.1.2 Eine Methode zur Differenzierung von PKC und PKM-Aktivität 37
3.1.3 Bestimmung eines spezifischen PKC-Inhibitors 38
3.1.4 Bestimmung eines PKM-Inhibitors 40
3.2 Inhibition der PKC-Aktivität während nicht assoziativer Lernprozessen 42
3.2.1 Habituation 42
3.2.2 Sensitisierung 42
3.3 Inhibition der PKC-Aktivität während und nach assoziativen Lernprozessen 43
3.3.1 Inhibition der PKC-Aktivität während der olfaktorischen Konditionierung 44
3.3.2 Inhibition der PKC-Aktivität bei der Gedächtnisbildung 45
3.4 Wird die Reduktion im Gedächtnis durch die Inhibition der PKC- oder der PKM-Aktivität verursacht? 47
3.5 Quantifizierung der PKC nach assoziativem Lernen 48
3.5.1 Eine Stunde nach dem Training wird weniger membrangebundenePKC detektiert 48
3.5.2 Die Inhibition der PKC-Aktivität verhindert die Reduktion der membrangebundenen PKC 51
3.5.3 Hinweise auf Komplexbildung durch Aufarbeitung mit Harnstoff und Trypsin 52
3.6 Direkter Nachweis von PKC-Proteinkomplexen 55
3.7 Nachweis der PKC-Komplexbildung nach der olfaktorischen Konditionierung 58
3.8 Identifikation eines PKC Bindeproteins 60
3.8.1 Charakterisierung eines RACK1-Antikörpers 60
3.8.2 Immunhistologische Untersuchung der RACK1 Verteilung im Bienengehirn 62
3.8.3 RACK1 bindet in den Kenyonzellen der Biene nur an aktive PKC 64
4. Diskussion 66
4.1 Untersuchungen zur Spezifität von PKC-Inhibitoren 66
4.2 Quantifizierung der PKC mit Hilfe eines Antikörpers 67
4.3 Nicht assoziative Lernen wird durch die Inhibitionder PKC-Aktivität nicht beeinflusst 68
4.4 PKC ist notwendig für das Langzeitgedächtnis von assoziativen Lernformen 69
4.5 Mechanismen der PKC Modulation bei plastischen Prozessen 72
4.6 PKC Bindeproteine und ihre Funktion 73
4.7 Hinweise für eine Interaktion der PKC mit Ankerproteinen bei der Gedächtnisbildung 76
4.8 Lerninduzierte Veränderungen der PKC im Gehirn der Honigbiene 77
4.9 Mögliche Funktionen der PKC Komplexbildung für die Etablierung von Langzeitgedächtnis 79
5. Zusammenfassung 82
6. Literatur, Abkürzungsliste, Lebenslauf, Danksagung 84
Liste der verwendeten Abkürzungen 98
Lebenslauf 99
Danksagung 101

Ergänzende Angaben:

Online-Adresse: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/261/index.html
Sprache: Deutsch
Keywords: protein kinase C, learning and memory, RACK1, anchoring proteins
DNB-Sachgruppe: 32 Biologie
Datum der Disputation: 11-Nov-2002
Entstanden am: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter: PD Dr. Uli Müller
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Randolf Menzel
Kontakt (Verfasser): pitu@zedat.fu-berlin.de
Kontakt (Betreuer): muelleru@zedat.fu-berlin
Abgabedatum:28-Nov-2002
Freigabedatum:02-Dec-2002

 

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