DARWIN Digitale Dissertationen German Version Strich

FU Berlin
Digitale Dissertation

Ulf Thomas :
Function of protein kinase C in the formation of long-term memory
Interaction of PKC with anchoring proteins in the mushroom bodies of the honeybee Apis mellifera
Die Rolle der Proteinkinase C bei der Bildung von Langzeitgedächtnis

 FU Logo

|Abstract| |Table of Contents| |More Information|

Abstract

This work investigates the role of protein kinase C in associative and non-associative learning in the honeybee Apis mellifera. Using specific inhibitors of PKC and the catalytic fragment PKM, we examined these enzymes? function in memory formation. The experimental data show that inhibition of PKC has no influence on non-associative learning such as habituation or sensitisation. But the inhibition of PKC at one hour after associative learning causes a significant reduction in memory, whereas inhibition before or after this distinct time point affects neither learning nor memory formation. Inhibition of PKM has no influence on associative and non-associative learning. Research on the mechanisms underlying learning and memory have shown that in the mushroom bodies the amount of PKC, which is located on the membrane, changed after olfactory learning. The amount of PKC was determined using the ELISA-technique at various time points after conditioning. Only at the distinct time point at which PKC inhibition caused defects in memory formation was a significant reduction observed in the amount of PKC. With the help of urea or trypsin we determined that it is not a reduction in the amount of PKC, but a blocking of the antibody binding site. This blocking depend on the interaction of PKC with other proteins. Inhibition of PKC one hour after olfactory conditioning, which causes a reduction in memory formation also prevents the binding of PKC to other proteins. These data show that in the mushroom bodies PKC interacts with proteins 1 ? 2 hours after olfactory conditioning and that these protein-protein interactions are necessary for memory formation. An Aligment of the amino acid sequences of already identified anchoring proteins for PKC and an amino acid database of the honeybee showed that a protein resembling RACK1 is found in the honeybee. Immunohistostaining of RACK1 showed that this protein is mainly expressed in the Kenyon cells of the mushroom bodies and in neurons of the antennal lobes. Within the calyces the immunostaining was much more intensive in the nucleus than in the cytosol. Immunoprecipitation demonstrated that RACK1 binds to activated PKC

Table of Contents

Download the whole PhDthesis as a zip-tar file or as zip-File

For download in PDF format click the chapter title

0. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 6
1.1 Lernen und neuronale Plastizität 6
1.1.1 Nicht-assoziative und assoziative Lernformen 6
1.1.2 Modellsysteme für die Untersuchung von Lern- und Gedächtnisphasen 8
1.1.3 Molekulare Mechanismen von Lernen und Gedächtnis 12
1.2 Protein Kinase C 15
1.2.1 Die PKC-Familie: Einteilung und Aktivatoren 15
1.2.2 Aktivierungsmechanismen der PKC 16
1.2.3 Substrate und Funktionen von neuronaler PKC 17
1.3 Ziel dieser Arbeit 18
2. Material und Methoden 20
2.1 Methoden 20
2.1.1 Vorbereitung der Versuchstiere 20
2.1.1.1 Habituation und Dishabituation 20
2.1.1.2 Sensitisierung 21
2.1.1.3 Olfaktorische Konditionierung 21
2.1.1.4 Injektion der Pharmaka 21
2.1.2 Immunchemische und immunhistologische Techniken 22
2.1.2.1 Präparation der Pilzkörper 22
2.1.2.2 Immunhistologie 23
2.1.2.3 Proteinquantifizierung mittels ELISA-Technik (Enzyme linked sorbent assay) 24
2.1.2.4 Westernblot 25
2.1.2.5 Immunpräzipitation 26
2.1.3 Bestimmung der Proteinkinase-Aktivität 27
2.1.4 Diskontinuierliche Gelelektrophorese 29
2.2 Material 30
2.2.1 Puffer und Lösungen 30
2.2.2 Chemikalien 32
2.2.3 Antikörper und Enzyme 33
2.2.4 Verbrauchsmaterialien 34
2.2.5 Geräte 34
3. Ergebnisse 35
3.1 Etablierung von Methoden zur Messung und Inhibition von PKC- und PKM-Aktivität 35
3.1.1 Die PKC-Gesamtaktivität kann nicht auf die PKC-Isoformen unterteilt werden 35
3.1.2 Eine Methode zur Differenzierung von PKC und PKM-Aktivität 37
3.1.3 Bestimmung eines spezifischen PKC-Inhibitors 38
3.1.4 Bestimmung eines PKM-Inhibitors 40
3.2 Inhibition der PKC-Aktivität während nicht assoziativer Lernprozessen 42
3.2.1 Habituation 42
3.2.2 Sensitisierung 42
3.3 Inhibition der PKC-Aktivität während und nach assoziativen Lernprozessen 43
3.3.1 Inhibition der PKC-Aktivität während der olfaktorischen Konditionierung 44
3.3.2 Inhibition der PKC-Aktivität bei der Gedächtnisbildung 45
3.4 Wird die Reduktion im Gedächtnis durch die Inhibition der PKC- oder der PKM-Aktivität verursacht? 47
3.5 Quantifizierung der PKC nach assoziativem Lernen 48
3.5.1 Eine Stunde nach dem Training wird weniger membrangebundenePKC detektiert 48
3.5.2 Die Inhibition der PKC-Aktivität verhindert die Reduktion der membrangebundenen PKC 51
3.5.3 Hinweise auf Komplexbildung durch Aufarbeitung mit Harnstoff und Trypsin 52
3.6 Direkter Nachweis von PKC-Proteinkomplexen 55
3.7 Nachweis der PKC-Komplexbildung nach der olfaktorischen Konditionierung 58
3.8 Identifikation eines PKC Bindeproteins 60
3.8.1 Charakterisierung eines RACK1-Antikörpers 60
3.8.2 Immunhistologische Untersuchung der RACK1 Verteilung im Bienengehirn 62
3.8.3 RACK1 bindet in den Kenyonzellen der Biene nur an aktive PKC 64
4. Diskussion 66
4.1 Untersuchungen zur Spezifität von PKC-Inhibitoren 66
4.2 Quantifizierung der PKC mit Hilfe eines Antikörpers 67
4.3 Nicht assoziative Lernen wird durch die Inhibitionder PKC-Aktivität nicht beeinflusst 68
4.4 PKC ist notwendig für das Langzeitgedächtnis von assoziativen Lernformen 69
4.5 Mechanismen der PKC Modulation bei plastischen Prozessen 72
4.6 PKC Bindeproteine und ihre Funktion 73
4.7 Hinweise für eine Interaktion der PKC mit Ankerproteinen bei der Gedächtnisbildung 76
4.8 Lerninduzierte Veränderungen der PKC im Gehirn der Honigbiene 77
4.9 Mögliche Funktionen der PKC Komplexbildung für die Etablierung von Langzeitgedächtnis 79
5. Zusammenfassung 82
6. Literatur, Abkürzungsliste, Lebenslauf, Danksagung 84
Liste der verwendeten Abkürzungen 98
Lebenslauf 99
Danksagung 101

More Information:

Online available: http://www.diss.fu-berlin.de/2002/261/indexe.html
Language of PhDThesis: german
Keywords: protein kinase C, learning and memory, RACK1, anchoring proteins
DNB-Sachgruppe: 32 Biologie
Date of disputation: 11-Nov-2002
PhDThesis from: Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie, Freie Universität Berlin
First Referee: PD Dr. Uli Müller
Second Referee: Prof. Dr. Randolf Menzel
Contact (Author): pitu@zedat.fu-berlin.de
Contact (Advisor): muelleru@zedat.fu-berlin
Date created:28-Nov-2002
Date available:02-Dec-2002

 

|| DARWIN|| Digitale Dissertationen || Dissertation|| German Version|| FU Berlin|| Seitenanfang ||

Mail-Icon Fragen und Kommentare an:
darwin@inf.fu-berlin.de

© Freie Universität Berlin 1999