FU Berlin Digitale Dissertation
Gerit Planitzer : Untersuchungen zur Stickstoffmonoxid-Synthase-1 (NOS-1)im Skelettmuskel der Ratte unter besonderer Benutzung dercomputergestützten Bildanalyse Research on Nitric Oxide Synthase-1 (NOS-1) in Rat Skeletal Muscle in Special Consideration of Computer-based Image Analysis
|Zusammenfassung| |Inhaltsverzeichnis| |Ergänzende Angaben|

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurde durch eine Kombination aus proteinbiochemischen, histochemischen und vor allem bildanalytischen Methoden das NOS-1/NO-System in den Skelettmuskelfasern von Ratten charakterisiert. Wesentliche Fragestellungen betrafen die Eignung der enzymhistochemischen NADPH-Diaphorase-Methode zum Nachweis der NOS-1, die Organisation des Enzyms in Costameren und seine Aktivität in den verschiedenen Typen von Skelettmuskelfasern. Desweiteren wurde die potentielle Regulation NO-sensitiver Enzyme untersucht. In der Literatur wurde bislang eine Reihe von Inhibitoren gegen NADPH-Diaphorasen beschrieben. In dieser Arbeit wurde allerdings gezeigt, daß es nicht möglich ist, mit diesen Inhibitoren die NOS-1 enzymhistochemisch von den anderen NADPH-Diaphorasen abzugrenzen. Dagegen wurde gezeigt, daß die Zugabe chaotroper Substanzen (wie Harnstoff) zum Inkubationsmedium eine Erhöhung der Spezifität der NADPH-Diaphorasereaktion in situ für NOS-1 bewirkt, indem andere in Skelettmuskelfasern der Ratte vorkommende NADPH-Diaphorasen gehemmt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß neben regulären auch irreguläre Costameren in Skelettmuskelfasern existieren. Irreguläre Costameren bestehen aus jeweils zwei Einzelringen, die einen regelmäßigen Abstand von 2 µm zueinander aufweisen (und somit Doppelringe bilden). Dagegen war der Abstand zwischen benachbarten irregulären Costameren äußerst unregelmäßig. Im Gegensatz zu regulären Costameren, die in 10 µm dicken Kryostatschnitten häufig zu finden sind, kommen irreguläre Costameren vorwiegend in Kryostatschnitten mit einer Dicke über 30 µm oder in gezupften Skelettmuskelfasern vor. Die irregulären Costameren ließen sich als Sarkolemminvaginationen identifizieren, die wesentlich häufiger in kontrahierten als in dilatierten Fasern auftreten. Deshalb kommen neben der NOS-1 auch andere Proteine des peripheren Cytoskeletts (z.B. Dystrophin) in irregulären Costameren vor, während intrafibrär lokalisierte Moleküle wie a-Actinin fehlen. Es wurde ein bildanalytisches Verfahren entwickelt, mit dem die katalytischen Eigenschaften der NOS-1-Diaphorase im Skelettmuskel auf Einzelfaserebene ermittelt werden konnten. Hierbei zeigte sich, daß die NOS-1 in schnellen (Typ II-) Skelettmuskelfasern höher konzentriert ist als in langsamen (Typ I-) Fasern. Desweiteren konnte nachgewiesen werden, daß innerhalb der Gruppe der schnellen Fasern eine positive Korrelation zwischen der oxidativen Stoffwechselkapazität (bildanalytisch bestimmt durch die SDH-Reaktion) und der bildanalytisch gemessenen NOS-1-Aktivität besteht. Außerdem konnte durch Bildanalyse gezeigt werden, daß von NO-Donatoren freigesetztes NO die Aktivität von Cytochrom-Oxidasen und GAPDH in situ hemmt. Je nach Aktivität dieser Enzyme in den verschiedenen Fasertypen vermag NO diese Fasern in unterschiedlichem Maße zu beeinflussen. Die c50% -Werte für die Cytochrom-Oxidasen waren in allen Fasertypen praktisch gleich. Sie lagen jedoch etwa um eine Größenordnung niedriger als die c50% -Werte für die GAPDH, bei denen es aber ebenfalls keine Unterschiede zwischen den Fasertypen gab. Die Experimente dieser Arbeit erbrachten neue Details zum NOS-1/NO-System im Skelettmuskel der Ratte. Die Anwendung der Bildanalyse auf die NOS-1-spezifische NADPH-Diaphorasereaktion zeigte, daß die NOS-1 in schnellen oxidativen (FOG-) Fasern die höchste Aktivität aufweist. Dieser Fasertyp weist auch die höchsten Aktivitäten potentieller Zielenzyme für NO auf. Weitere Experimente belegten mit bildanalytischen Methoden, daß diese Enzyme in situ von NO inhibiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen somit Vorstellungen, nach denen das von der NOS-1 in Skelettmuskelfasern produzierte NO den glycolytischen und oxidativen Stoffwechsel der Muskelfasern hemmt, wodurch eine Verringerung des Energieverbrauchs des Skelettmuskels erzielt wird.

Inhaltsverzeichnis Die gesamte Dissertation können Sie als gezippten tar-File oder als zip-File laden. Durch Anklicken der Kapitelüberschriften können Sie das Kapitel in PDF-Format laden: 0. Titelblatt 1. Einleitung 1.1. Stickstoffmonoxid und Stickstoffmonoxid-Synthasen 1 1.2. Stickstoffmonoxid-Synthasen im Skelettmuskel 2 1.3. Nachweisverfahren für die NOS-1 im Skelettmuskel 1.3.1. Biochemische Nachweise 4 1.3.2. Immunhistochemische Nachweise 4 1.3.3. Enzymhistochemische Nachweise 5 1.4. Costameren 6 1.5. Bildanalyse enzymhistochemischer Reaktionen 8 1.6. Zielsetzung der Arbeit 9 2. Material und Methoden 2.1. Gewinnung und Aufarbeitung der Gewebsproben 2.1.1. Gewebsproben für histochemische und biochemische Untersuchungen 11 2.1.2. Kontrahierte und dilatierte Muskelproben 12 2.1.3. Gezupfte Skelettmuskelfasern 12 2.2. Katalytische Histochemie 2.2.1. Allgemeine Vorbehandlung der Kryostatschnitte 13 2.2.2. NADPH-Diaphorase / NOS-1-Diaphorase 2.2.2.1. Standardmedium für die NADPH-Diaphorase 13 2.2.2.2. Leerwertuntersuchungen 14 2.2.2.3. Modifikation des Standardmediums für die NOS-1-Diaphorase 14 2.2.2.4. Formazanquantifizierung in Kryostatschnitten 14 2.2.3. NADH-Diaphorase 15 2.2.4. Succinat-Dehydrogenase 15 2.2.5. Cytochrom-Oxidasen 15 2.2.6. Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 16 2.2.7. Experimente mit NO-Donatoren 16 2.3. Immunhistochemie 2.3.1. Vorbehandlung der Kryostatschnitte 17 2.3.2. Primärantikörper 17 2.3.3. Sekundärantikörper, Visualisierung 18 2.4. Proteinbiochemische Methoden 2.4.1. Probenaufarbeitung 19 2.4.2. Proteinbestimmung 19 2.4.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 19 2.4.4. Western-Blot 21 2.4.5. Färbeverfahren 21 2.4.6. Visualisierung gelelektrophoretisch aufgetrennter Proteine 22 2.5. Bildanalyse 2.5.1. Geräte, Software 23 2.5.2. Messungen räumlicher Größen 2.5.2.1. Messung des Sarkolemmgehaltes 24 2.5.3. Extinktionsmessungen, Datenaufarbeitung 2.5.3.1. Statische Extinktionsmessungen (Endpunktmessungen) 25 2.5.3.2. Fortlaufende Extinktionsmessungen (Kinetische Messungen) 25 2.5.3.3. Grundlagen der Messung von Grauwerten in Kryostatschnitten 26 2.5.3.4. Datenaufarbeitung 30 2.6. Statistik 2.6.1. Allgemeine statistische Angaben 32 2.6.2. Mittelwertvergleiche 32 2.6.3. Tests auf Korrelation zweier Merkmale 33 2.6.4. Meßwiederholungsstudie 33 3. Ergebnisse 3.1. Verteilungsmuster der NADPH-Diaphoraseaktivität in Skelettmuskelfasern 3.1.1. Vergleich mit den Verteilungsmustern von NADH-Diaphorase, SDH, MHC und SERCA-1 3.1.1.1. Längsschnitte von Skelettmuskelfasern 34 3.1.1.2. Querschnitte von Skelettmuskelfasern 37 3.1.2. Charakterisierung der NADPH-Diaphorasen mit Inhibitoren 39 3.1.3. Vergleich mit dem Verteilungsmuster der NOS-1-Immunfluoreszenz 41 3.2. NOS-1 als costamerisch organisiertes Enzym im Sarkolemm von Skelettmuskelfasern 3.2.1. Reguläre und irreguläre Costameren in 60 µm dicken Kryostatschnitten 3.2.1.1. Charakterisierung durch NOS-1-Diaphorase 43 3.2.1.2. Charakterisierung durch NOS-1-Immunhistochemie 46 3.2.2. Reguläre und irreguläre Costameren in gezupften Fasern 49 3.2.3. Funktionelle Analyse irregulärer Costameren 50 3.3. NOS-1 in verschiedenen Skelettmuskelfasertypen 3.3.1. Überprüfung des bildanalytischen Verfahrens zur Messung von Enzymaktivitäten 3.3.1.1. Vergleich der Messungen mit und ohne Berechnung der Fuzzy-Maske 52 3.3.1.2. Meßwiederholungsstudie 53 3.3.2. Expression der NOS-1 in verschiedenen Skelettmuskeln 3.3.2.1. Quantitative Analyse mittels Western-Blot 53 3.3.2.2. Qualitativ-histochemische NOS-1-Faserverteilung 55 3.3.2.3. Quantifizierung von NOS-1-Protein und NOS-1-Diaphoraseaktivität 56 3.3.2.4. Enzymkinetische Parameter und NOS-1-Verteilung in verschiedenen Fasertypen 58 3.3.3. Bildanalytische Aktivitätsmessung der NOS-1 in verschiedenen Fasertypen 60 3.3.4. Wirkung von NO-Donatoren auf Cytochrom-Oxidasen und GAPDH 61 4. Diskussion 4.1. NADPH-Diaphoraseaktivität als spezifischer Nachweis für NOS-1 im Skelettmuskel 64 4.2. NOS-1 als costamerisch organisiertes Enzym 69 4.3. Fasertypabhängige Expression der NOS-1 73 4.4. Biologische Wirkung des NOS-1/NO-Systems im Skelettmuskel 75 4.5. Wert bildanalytischer Verfahren zur Aktivitätsmessung von Enzymen 78 5. Zusammenfassung 81 6. Literaturverzeichnis 83 Anhang Verwendete Abkürzungen I Lebenslauf II Danksagung III

Ergänzende Angaben:
Online-Adresse:	http://www.diss.fu-berlin.de/2002/69/index.html
Sprache:	Deutsch
Keywords:	nitric oxide NOS-1 costameres diaphorase image analysis
DNB-Sachgruppe:	33 Medizin
Datum der Disputation:	16-Apr-2002
Entstanden am:	Fachbereich Humanmedizin, Freie Universität Berlin
Erster Gutachter:	Prof. Dr. med. Reinhart Gossrau
Zweiter Gutachter:	Prof. Dr. M. Bräutigam
Kontakt (Verfasser):	planitz@zedat.fu-berlin.de
Kontakt (Betreuer):	gossrau@ukbf.fu-berlin.de
Abgabedatum:	07-May-2002
Freigabedatum:	08-May-2002

 

---

|| DARWIN|| Digitale Dissertationen || Dissertation|| English Version|| FU Berlin|| Seitenanfang ||

---

	Fragen und Kommentare an: darwin@inf.fu-berlin.de
© Freie Universität Berlin 1999