FU Berlin Digitale Dissertation
Gerit Planitzer : Research on Nitric Oxide Synthase-1 (NOS-1) in Rat Skeletal Muscle in Special Consideration of Computer-based Image Analysis Untersuchungen zur Stickstoffmonoxid-Synthase-1 (NOS-1)im Skelettmuskel der Ratte unter besonderer Benutzung dercomputergestützten Bildanalyse
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Abstract The research presented in this thesis shows how the NOS-1/NO-system of rat skeletal muscle fibers was characterized by using a combination of protein biochemical and histochemical methods with image analysis. The experiments focused its attention on the applicability of the catalytic histochemical NADPH diaphorase reaction for evidence of NOS-1, the organization of this enzyme in costameres and its catalytic activity in different types of myofibers. Further studies concentrated on the possible regulation of NO-sensitive enzymes for potential inhibiting functions of NO in myofibers. Other researched papers have identified several inhibitors of NADPH diaphorases. In contrast to this information, the experiments undertaken as part of this study yielded that it was not possible to discriminate NOS-1 from the other NADPH diaphorases by the use of these inhibitors. Conversely, it was found that chaotropic reagents for example, urea whilst in the incubation medium exhibited a specificity of the NADPH diaphorase reaction for NOS-1 in situ, whereas other NADPH diaphorases present in rat myofibers were inhibited. The experiments also identified that in skeletal muscle fibers both regular and irregular costameres exist. They also found, firstly, that every irregular costamere consists of two separate rings ,with a measured constant distance of 2 µm between each ring thus forming double rings. Whereas the distance between adjacent irregular costameres was found to be consistently irregular. Secondly, regular costameres were frequently found in 10 µm thick cryosections. Conversely, irregular costameres were primarily detected in cryosections with a thickness of more than 30 µm. They were alternatively found in teased myofibers. Thirdly, irregular costameres were identified as sarcolemma invaginations appearing more frequently in contracted myofibers than in dilated ones. Therefore, besides NOS-1 other proteins of the peripheral cytoskeleton (i.e. dystrophin) are found in irregular costameres. An image-analysis based procedure was developed in order to determine the catalytic properties of NOS-1 diaphorase in skeletal muscle at the level of single myofibers. In this way, it was shown that the concentration of NOS-1 is higher in fast (type II) myofibers than in slow (type I ) ones. Furthermore it was verified that within the group of fast myofibers there is a positive correlation between the oxidative capacity (determined by image analysis of SDH reaction) and the activity of NOS-1 measured by image analysis. It was shown also via image analysis that NO released by NO donors inhibits the activity of cytochrome oxidases and GAPDH in situ. Dependent on the basal activity of these enzymes in different fiber types, NO can distinctively influence these fiber types. The c50% values for cytochrome oxidases were similar in all fiber types. They were, however, lower by a factor of 10 than the c50% values for GAPDH which also showed no differences among the fiber types. The experiments undertaken in this thesis identified new details of the NOS-1/NO system in rat skeletal muscles. The application of image analysis on the NOS-1-specific NADPH diaphorase reaction showed that NOS-1 is most active in fast oxidative (FOG) myofibers. At the same time, this fiber type presents highest activities of potential target enzymes of NO. Further experiments verified via image analysis that these enzymes are inhibited in situ by NO. Thus, the results of this thesis support suggestions that the NO produced by NOS-1 in myofibers downregulates the glycolytic and oxidative metabolism of myofibers with the effect of decreasing energy consumption of skeletal muscles.

Table of Contents Download the whole PhDthesis as a zip-tar file or as zip-File For download in PDF format click the chapter title 0. Titelblatt 1. Einleitung 1.1. Stickstoffmonoxid und Stickstoffmonoxid-Synthasen 1 1.2. Stickstoffmonoxid-Synthasen im Skelettmuskel 2 1.3. Nachweisverfahren für die NOS-1 im Skelettmuskel 1.3.1. Biochemische Nachweise 4 1.3.2. Immunhistochemische Nachweise 4 1.3.3. Enzymhistochemische Nachweise 5 1.4. Costameren 6 1.5. Bildanalyse enzymhistochemischer Reaktionen 8 1.6. Zielsetzung der Arbeit 9 2. Material und Methoden 2.1. Gewinnung und Aufarbeitung der Gewebsproben 2.1.1. Gewebsproben für histochemische und biochemische Untersuchungen 11 2.1.2. Kontrahierte und dilatierte Muskelproben 12 2.1.3. Gezupfte Skelettmuskelfasern 12 2.2. Katalytische Histochemie 2.2.1. Allgemeine Vorbehandlung der Kryostatschnitte 13 2.2.2. NADPH-Diaphorase / NOS-1-Diaphorase 2.2.2.1. Standardmedium für die NADPH-Diaphorase 13 2.2.2.2. Leerwertuntersuchungen 14 2.2.2.3. Modifikation des Standardmediums für die NOS-1-Diaphorase 14 2.2.2.4. Formazanquantifizierung in Kryostatschnitten 14 2.2.3. NADH-Diaphorase 15 2.2.4. Succinat-Dehydrogenase 15 2.2.5. Cytochrom-Oxidasen 15 2.2.6. Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 16 2.2.7. Experimente mit NO-Donatoren 16 2.3. Immunhistochemie 2.3.1. Vorbehandlung der Kryostatschnitte 17 2.3.2. Primärantikörper 17 2.3.3. Sekundärantikörper, Visualisierung 18 2.4. Proteinbiochemische Methoden 2.4.1. Probenaufarbeitung 19 2.4.2. Proteinbestimmung 19 2.4.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 19 2.4.4. Western-Blot 21 2.4.5. Färbeverfahren 21 2.4.6. Visualisierung gelelektrophoretisch aufgetrennter Proteine 22 2.5. Bildanalyse 2.5.1. Geräte, Software 23 2.5.2. Messungen räumlicher Größen 2.5.2.1. Messung des Sarkolemmgehaltes 24 2.5.3. Extinktionsmessungen, Datenaufarbeitung 2.5.3.1. Statische Extinktionsmessungen (Endpunktmessungen) 25 2.5.3.2. Fortlaufende Extinktionsmessungen (Kinetische Messungen) 25 2.5.3.3. Grundlagen der Messung von Grauwerten in Kryostatschnitten 26 2.5.3.4. Datenaufarbeitung 30 2.6. Statistik 2.6.1. Allgemeine statistische Angaben 32 2.6.2. Mittelwertvergleiche 32 2.6.3. Tests auf Korrelation zweier Merkmale 33 2.6.4. Meßwiederholungsstudie 33 3. Ergebnisse 3.1. Verteilungsmuster der NADPH-Diaphoraseaktivität in Skelettmuskelfasern 3.1.1. Vergleich mit den Verteilungsmustern von NADH-Diaphorase, SDH, MHC und SERCA-1 3.1.1.1. Längsschnitte von Skelettmuskelfasern 34 3.1.1.2. Querschnitte von Skelettmuskelfasern 37 3.1.2. Charakterisierung der NADPH-Diaphorasen mit Inhibitoren 39 3.1.3. Vergleich mit dem Verteilungsmuster der NOS-1-Immunfluoreszenz 41 3.2. NOS-1 als costamerisch organisiertes Enzym im Sarkolemm von Skelettmuskelfasern 3.2.1. Reguläre und irreguläre Costameren in 60 µm dicken Kryostatschnitten 3.2.1.1. Charakterisierung durch NOS-1-Diaphorase 43 3.2.1.2. Charakterisierung durch NOS-1-Immunhistochemie 46 3.2.2. Reguläre und irreguläre Costameren in gezupften Fasern 49 3.2.3. Funktionelle Analyse irregulärer Costameren 50 3.3. NOS-1 in verschiedenen Skelettmuskelfasertypen 3.3.1. Überprüfung des bildanalytischen Verfahrens zur Messung von Enzymaktivitäten 3.3.1.1. Vergleich der Messungen mit und ohne Berechnung der Fuzzy-Maske 52 3.3.1.2. Meßwiederholungsstudie 53 3.3.2. Expression der NOS-1 in verschiedenen Skelettmuskeln 3.3.2.1. Quantitative Analyse mittels Western-Blot 53 3.3.2.2. Qualitativ-histochemische NOS-1-Faserverteilung 55 3.3.2.3. Quantifizierung von NOS-1-Protein und NOS-1-Diaphoraseaktivität 56 3.3.2.4. Enzymkinetische Parameter und NOS-1-Verteilung in verschiedenen Fasertypen 58 3.3.3. Bildanalytische Aktivitätsmessung der NOS-1 in verschiedenen Fasertypen 60 3.3.4. Wirkung von NO-Donatoren auf Cytochrom-Oxidasen und GAPDH 61 4. Diskussion 4.1. NADPH-Diaphoraseaktivität als spezifischer Nachweis für NOS-1 im Skelettmuskel 64 4.2. NOS-1 als costamerisch organisiertes Enzym 69 4.3. Fasertypabhängige Expression der NOS-1 73 4.4. Biologische Wirkung des NOS-1/NO-Systems im Skelettmuskel 75 4.5. Wert bildanalytischer Verfahren zur Aktivitätsmessung von Enzymen 78 5. Zusammenfassung 81 6. Literaturverzeichnis 83 Anhang Verwendete Abkürzungen I Lebenslauf II Danksagung III

More Information:
Online available:	http://www.diss.fu-berlin.de/2002/69/indexe.html
Language of PhDThesis:	german
Keywords:	nitric oxide NOS-1 costameres diaphorase image analysis
DNB-Sachgruppe:	33 Medizin
Date of disputation:	16-Apr-2002
PhDThesis from:	Fachbereich Humanmedizin, Freie Universität Berlin
First Referee:	Prof. Dr. med. Reinhart Gossrau
Second Referee:	Prof. Dr. M. Bräutigam
Contact (Author):	planitz@zedat.fu-berlin.de
Contact (Advisor):	gossrau@ukbf.fu-berlin.de
Date created:	07-May-2002
Date available:	08-May-2002

 

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